Javascript зараз вимкнено у вашому браузері.Якщо javascript вимкнено, деякі функції цього сайту не працюватимуть.
Зареєструйте ваші конкретні дані та конкретні препарати, які вас цікавлять, і ми зіставимо надану вами інформацію зі статтями в нашій великій базі даних і своєчасно надішлемо вам PDF-копію електронною поштою.
Контролюйте рух магнітних наночастинок оксиду заліза для адресної доставки цитостатиків
Автор Торопова Ю., Корольов Д., Істоміна М., Шульмейстер Г., Пєтухов А., Мішанін В., Горшков А., Под'ячева Е., Гарєєв К., Багров А., Демидов О.
Яна Торопова,1 Дмитро Корольов,1 Марія Істоміна,1,2 Галина Шульмейстер,1 Олексій Пєтухов,1,3 Володимир Мішанін,1 Андрій Горшков,4 Катерина Подьячева,1 Каміль Гарєєв,2 Олексій Багров,5 Олег Демидов6,71Almazov National Medical Науковий центр МОЗ Російської Федерації, Санкт-Петербург, 197341, Російська Федерація;2 Санкт-Петербурзький електротехнічний університет «ЛЕТІ», Санкт-Петербург, 197376, Російська Федерація;3 Центр персоналізованої медицини ГМНЦ імені Алмазова МОЗ Російської Федерації, 197341, Російська Федерація, Санкт-Петербург;4ФДМУ «НДІ грипу імені А. А. Смородинцева» МОЗ Російської Федерації, м. Санкт-Петербург, Російська Федерація;5 Інститут еволюційної фізіології та біохімії імені Сеченова Російської академії наук, Санкт-Петербург, Російська Федерація;6 Інститут цитології РАН, Санкт-Петербург, 194064, Російська Федерація;7INSERM U1231, Факультет медицини та фармації, Університет Бургонь-Франш-Комте, Діжон, Франція Комунікація: Національний медичний дослідницький центр Яна Торопова Алмазова, Міністерство охорони здоров’я Російської Федерації, Санкт-Петербург, 197341, Російська Федерація Тел. +7 981 95264800 4997069 Електронна пошта [email protected] Передумови: Перспективним підходом до проблеми цитостатичної токсичності є використання магнітних наночастинок (MNP) для адресної доставки ліків.Мета: використовувати розрахунки для визначення найкращих характеристик магнітного поля, яке контролює MNP in vivo, і оцінити ефективність магнетронної доставки MNP до пухлин миші in vitro та in vivo.(MNPs-ICG).Дослідження інтенсивності люмінесценції in vivo проводили на мишах із пухлиною, з магнітним полем у ділянці інтересу та без нього.Ці дослідження проводилися на гідродинамічному каркасі, розробленому Інститутом експериментальної медицини ГМНЦ імені Алмазова МОЗ Росії.Результат: використання неодимових магнітів сприяло виборчому накопиченню MNP.Через одну хвилину після введення MNPs-ICG мишам з пухлиною MNPs-ICG в основному накопичується в печінці.За відсутності та наявності магнітного поля це вказує на його метаболічний шлях.Хоча в присутності магнітного поля спостерігалося збільшення флуоресценції в пухлині, інтенсивність флуоресценції в печінці тварини не змінювалася з часом.Висновок: цей тип MNP у поєднанні з розрахованою напруженістю магнітного поля може бути основою для розробки магнітно-керованої доставки цитостатичних препаратів до пухлинних тканин.Ключові слова: флуоресцентний аналіз, індоціанін, наночастинки оксиду заліза, магнетронна доставка цитостатиків, таргетування пухлин.
Пухлинні захворювання є однією з головних причин смертності в усьому світі.Водночас динаміка зростання захворюваності та смертності від пухлинних захворювань зберігається.1 Хіміотерапія, яка використовується сьогодні, все ще залишається одним із основних методів лікування різних пухлин.Водночас розробка методів зниження системної токсичності цитостатиків залишається актуальною.Перспективним методом вирішення проблеми його токсичності є використання нанорозмірних носіїв для цільових методів доставки ліків, які можуть забезпечити локальне накопичення ліків у тканинах пухлини без збільшення їх накопичення в здорових органах і тканинах.концентрація.2 Цей метод дозволяє підвищити ефективність і спрямованість хіміотерапевтичних препаратів на пухлинні тканини, одночасно знижуючи їх системну токсичність.
Серед різних наночастинок, які розглядаються для цільової доставки цитостатичних агентів, магнітні наночастинки (MNP) представляють особливий інтерес через їхні унікальні хімічні, біологічні та магнітні властивості, які забезпечують їх універсальність.Тому магнітні наночастинки можна використовувати як систему нагріву для лікування пухлин за допомогою гіпертермії (магнітної гіпертермії).Також їх можна використовувати як діагностичні засоби (магнітно-резонансна діагностика).3-5 Використовуючи ці характеристики в поєднанні з можливістю накопичення MNP у певній області за допомогою зовнішнього магнітного поля, доставка цільових фармацевтичних препаратів відкриває можливість створення багатофункціональної магнетронної системи для націлювання цитостатиків на місце пухлини Перспективи.Така система включала б MNP і магнітні поля для контролю їх руху в тілі.У цьому випадку як джерело магнітного поля можуть бути використані як зовнішні магнітні поля, так і магнітні імплантати, розміщені в області тіла, що містить пухлину.6 Перший метод має серйозні недоліки, серед яких необхідність використання спеціалізованого обладнання для магнітного націлювання препаратів та необхідність навчання персоналу для проведення хірургічних операцій.Крім того, цей метод обмежений високою вартістю і підходить тільки для «поверхневих» пухлин, розташованих близько до поверхні тіла.Альтернативний метод використання магнітних імплантатів розширює сферу застосування цієї технології, полегшуючи її застосування на пухлинах, розташованих в різних частинах тіла.Як окремі магніти, так і магніти, інтегровані у внутрішньопросвітний стент, можна використовувати як імплантати при пошкодженні пухлини в порожнистих органах для забезпечення їх прохідності.Однак, згідно з нашими власними неопублікованими дослідженнями, вони недостатньо магнітні, щоб забезпечити утримання MNP із кровотоку.
Ефективність магнетронної доставки ліків залежить від багатьох факторів: характеристик самого магнітного носія та характеристик джерела магнітного поля (включаючи геометричні параметри постійних магнітів і напруженість магнітного поля, яке вони створюють).Розробка успішної технології доставки клітинних інгібіторів з магнітним керуванням повинна включати розробку відповідних магнітних нанорозмірних носіїв ліків, оцінку їх безпеки та розробку протоколу візуалізації, який дозволяє відстежувати їхні рухи в організмі.
У цьому дослідженні ми математично розрахували оптимальні характеристики магнітного поля для контролю магнітного нанорозмірного носія ліків в організмі.Можливість утримання MNP через стінку кровоносної судини під впливом прикладеного магнітного поля з такими обчислювальними характеристиками також вивчалася в ізольованих кровоносних судинах щурів.Крім того, ми синтезували кон'югати MNP і флуоресцентних агентів і розробили протокол для їх візуалізації in vivo.В умовах in vivo на модельних пухлинних мишах вивчали ефективність накопичення МНЧ у тканинах пухлини при системному введенні під впливом магнітного поля.
У дослідженні in vitro ми використовували еталонний MNP, а в дослідженні in vivo ми використовували MNP, покритий поліефіром молочної кислоти (полімолочною кислотою, PLA), що містить флуоресцентний агент (індолеціанін; ICG).MNP-ICG входить до складу In case, use (MNP-PLA-EDA-ICG).
Синтез і фізичні та хімічні властивості MNP були детально описані в іншому місці.7,8
Щоб синтезувати MNPs-ICG, спочатку були отримані кон'югати PLA-ICG.Використовували порошкову рацемічну суміш PLA-D і PLA-L з молекулярною масою 60 кДа.
Оскільки PLA і ICG є кислотами, щоб синтезувати кон’югати PLA-ICG, спочатку потрібно синтезувати спейсер із кінцевою аміногрупою на PLA, який допомагає ICG хемосорбуватися на спейсері.Спейсер був синтезований з використанням етилендіаміну (EDA), карбодиімідним методом і водорозчинного карбодііміду, 1-етил-3-(3-диметиламінопропіл) карбодиіміду (EDAC).Спейсер PLA-EDA синтезується наступним чином.Додайте 20-кратний молярний надлишок EDA і 20-кратний молярний надлишок EDAC до 2 мл 0,1 г/мл розчину PLA хлороформу.Синтез проводили в поліпропіленовій пробірці на 15 мл на шейкері при швидкості 300 хв-1 протягом 2 годин.Схема синтезу показана на рисунку 1. Повторіть синтез із 200-кратним надлишком реагентів, щоб оптимізувати схему синтезу.
Наприкінці синтезу розчин центрифугували зі швидкістю 3000 хв-1 протягом 5 хвилин для видалення надлишку осаджених похідних поліетилену.Потім до 2 мл розчину додавали 2 мл 0,5 мг/мл розчину ICG у диметилсульфоксиді (DMSO).Мішалку фіксують на швидкості перемішування 300 хв-1 протягом 2 годин.Принципова діаграма отриманого кон'югату показана на малюнку 2.
У 200 мг MNP ми додали 4 мл кон'югату PLA-EDA-ICG.Шейкером ЛС-220 (ЛОІП, Росія) суспензію перемішують протягом 30 хвилин з частотою 300 хв-1.Потім його тричі промивали ізопропанолом і піддавали магнітній сепарації.Ультразвуковим диспергатором УЗД-2 (ФГУП НДІ ТВЧ, Росія) до суспензії додають ІПА протягом 5-10 хвилин під безперервною ультразвуковою дією.Після третього промивання IPA осад промивали дистильованою водою та ресуспендували у фізіологічному розчині в концентрації 2 мг/мл.
Для дослідження розподілу отриманих МНЧ за розмірами у водному розчині використовували апаратуру ZetaSizer Ultra (Malvern Instruments, Великобританія).Для дослідження форми та розміру МНЧ використовували просвічуючий електронний мікроскоп (ТЕМ) з автоемісійним катодом JEM-1400 STEM (JEOL, Японія).
У цьому дослідженні ми використовуємо циліндричні постійні магніти (клас N35; із захисним покриттям з нікелю) і такі стандартні розміри (довжина довгої осі × діаметр циліндра): 0,5 × 2 мм, 2 × 2 мм, 3 × 2 мм і 5 × 2 мм.
Дослідження транспорту MNP в модельній системі in vitro проводили на гідродинамічному каркасі, розробленому НДІ експериментальної медицини ГМНЦ імені Алмазова МОЗ Росії.Об'єм циркулюючої рідини (дистильованої води або розчину Кребса-Генселейта) становить 225 мл.В якості постійних магнітів використовують циліндричні магніти, намагнічені по осі.Помістіть магніт на тримач на відстані 1,5 мм від внутрішньої стінки центральної скляної трубки так, щоб його кінець був спрямований у напрямку трубки (вертикально).Швидкість потоку рідини в замкнутому контурі становить 60 л/год (що відповідає лінійній швидкості 0,225 м/с).Розчин Кребса-Гензелейта використовується як циркулююча рідина, оскільки є аналогом плазми.Коефіцієнт динамічної в'язкості плазми становить 1,1-1,3 мПа∙с.9 Кількість MNP, адсорбованого в магнітному полі, визначається спектрофотометрично за концентрацією заліза в циркулюючій рідині після експерименту.
Крім того, були проведені експериментальні дослідження на вдосконаленій таблиці механіки рідини для визначення відносної проникності кровоносних судин.Основні компоненти гідродинамічної опори показані на малюнку 3. Основними компонентами гідродинамічного стента є замкнутий контур, який імітує поперечний переріз модельної судинної системи, і резервуар для зберігання.Рух модельної рідини по контуру модуля кровоносної судини забезпечує перистальтичний насос.Під час експерименту підтримуйте випаровування та необхідний діапазон температур, а також контролюйте параметри системи (температуру, тиск, швидкість потоку рідини та значення pH).
Рисунок 3 Блок-схема установки для дослідження проникності стінки сонної артерії.1-накопичувач, 2-перистальтичний насос, 3-механізм введення суспензії, що містить МНП в контур, 4-витратомір, 5-датчик тиску в контурі, 6-теплообмінник, 7-камера з ємністю, 8-джерело. магнітного поля, 9-балон з вуглеводнями.
Камера, що містить контейнер, складається з трьох контейнерів: зовнішнього великого контейнера та двох малих контейнерів, через які проходять плечі центрального контуру.Канюлю вставляють у маленький контейнер, контейнер нанизують на маленький контейнер, а кінчик канюлі туго зав'язують тонким дротом.Простір між великою та малою ємностями заповнюється дистильованою водою, а температура залишається постійною завдяки підключенню до теплообмінника.Простір у маленькому контейнері заповнений розчином Кребса-Генселайта для підтримки життєздатності клітин кровоносних судин.Резервуар також заповнений розчином Кребса-Хенселайта.Система подачі газу (вуглецю) використовується для випаровування розчину в невеликому контейнері в резервуарі для зберігання та камері, що містить контейнер (рис. 4).
Малюнок 4 Камера, де розміщено контейнер.1-Канюля для опускання судин, 2-Зовнішня камера, 3-Мала камера.Стрілка вказує напрям модельної рідини.
Для визначення показника відносної проникності стінки судини використовували сонну артерію щура.
Введення в систему суспензії MNP (0,5 мл) має наступні характеристики: загальний внутрішній об’єм резервуара і з’єднувальної труби в петлі становить 20 мл, а внутрішній об’єм кожної камери – 120 мл.Джерелом зовнішнього магнітного поля є постійний магніт стандартного розміру 2×3 мм.Його встановлюють над однією з малих камер, на відстані 1 см від контейнера, одним кінцем до стінки контейнера.Температуру тримають на рівні 37°С.Потужність роликового насоса встановлена ​​на 50%, що відповідає швидкості 17 см/с.Для контролю зразки відбирали в камері без постійних магнітів.
Через годину після введення заданої концентрації MNP з камери брали зразок рідини.Концентрацію частинок вимірювали спектрофотометром з використанням спектрофотометра Unico 2802S UV-Vis (United Products & Instruments, США).Враховуючи спектр поглинання суспензії MNP, вимірювання проводили при 450 нм.
Згідно з рекомендаціями Rus-LASA-FELASA, усі тварини вирощуються та вирощуються в спеціальних приміщеннях, вільних від патогенів.Це дослідження відповідає всім відповідним етичним нормам для експериментів і досліджень на тваринах і отримало етичне схвалення від Національного медичного дослідницького центру імені Алмазова (IACUC).Тварини пили воду досхочу і регулярно годували.
Дослідження проводили на 10 анестезованих 12-тижневих самцях мишей NSG з імунодефіцитом (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/Szj, Jackson Laboratory, США) 10, вагою 22 г ± 10%.Оскільки імунодефіцит мишей пригнічений, імунодефіцитні миші цієї лінії дозволяють трансплантувати клітини і тканини людини без відторгнення трансплантата.Однопометники з різних клітин були випадковим чином розподілені в експериментальну групу, і їх спільно розводили або систематично виставляли на підстилку інших груп, щоб забезпечити рівний вплив загальної мікробіоти.
Лінія людських ракових клітин HeLa використовується для створення моделі ксенотрансплантата.Клітини культивували в DMEM, що містить глутамін («ПанЕко», Росія), з додаванням 10% фетальної бичачої сироватки («Hyclone», США), 100 КУО/мл пеніциліну та 100 мкг/мл стрептоміцину.Лінія клітин люб'язно надана Лабораторією регуляції експресії генів Інституту клітинних досліджень РАН.Перед ін’єкцією клітини HeLa видаляли з культурального пластику розчином трипсин:Версен 1:1 («Біолот», Росія).Після промивання клітини суспендували в повному середовищі до концентрації 5×106 клітин на 200 мкл і розбавляли матрицею базальної мембрани (LDEV-FREE, MATRIGEL® CORNING®) (1:1, на льоду).Приготовану клітинну суспензію вводили підшкірно в шкіру стегна миші.Використовуйте електронний штангенциркуль для моніторингу росту пухлини кожні 3 дні.
Коли пухлина досягала 500 мм3, в м'язову тканину піддослідної тварини поблизу пухлини імплантували постійний магніт.В експериментальній групі (MNPs-ICG + tumor-M) вводили 0,1 мл суспензії MNP і піддавали дії магнітного поля.Нелікованих цілих тварин використовували як контроль (фон).Крім того, використовували тварин, яким вводили 0,1 мл MNP, але не імплантували магніти (MNPs-ICG + tumor-BM).
Візуалізацію флуоресценції зразків in vivo та in vitro проводили на біовізуализаторі IVIS Lumina LT series III (PerkinElmer Inc., США).Для візуалізації in vitro в лунки планшета додали об’єм 1 мл синтетичного кон’югату PLA-EDA-ICG і MNP-PLA-EDA-ICG.З урахуванням характеристик флуоресценції барвника ICG обрано найкращий фільтр для визначення сили світла зразка: максимальна довжина хвилі збудження становить 745 нм, а довжина хвилі випромінювання – 815 нм.Для кількісного вимірювання інтенсивності флуоресценції лунок, що містять кон'югат, використовували програмне забезпечення Living Image 4.5.5 (PerkinElmer Inc.).
Інтенсивність флуоресценції та накопичення кон'югату MNP-PLA-EDA-ICG вимірювали на мишах моделі пухлини in vivo без присутності та застосування магнітного поля в цікавому місці.Мишей анестезували ізофлураном, а потім через хвостову вену вводили 0,1 мл кон'югату MNP-PLA-EDA-ICG.Необроблених мишей використовували як негативний контроль для отримання флуоресцентного фону.Після внутрішньовенного введення кон’югату помістіть тварину на нагрівач (37°C) у камері флуоресцентної камери IVIS Lumina LT серії III (PerkinElmer Inc.), продовжуючи інгаляцію під анестезією 2% ізофлурану.Використовуйте вбудований фільтр ICG (745–815 нм) для виявлення сигналу через 1 хвилину та 15 хвилин після введення MNP.
Для оцінки накопичення кон'югату в пухлині область очеревини тварини покривали папером, що дозволяло усунути яскраву флуоресценцію, пов'язану з накопиченням частинок в печінці.Після вивчення біорозподілу MNP-PLA-EDA-ICG тварин піддавали гуманній евтаназії шляхом анестезії передозування ізофлурану для подальшого відокремлення ділянок пухлини та кількісної оцінки флуоресцентного випромінювання.Використовуйте програмне забезпечення Living Image 4.5.5 (PerkinElmer Inc.), щоб вручну обробити аналіз сигналу з вибраної області інтересу.Для кожної тварини було проведено три вимірювання (n = 9).
У цьому дослідженні ми не оцінювали успішне завантаження ICG на MNPs-ICG.Крім того, ми не порівнювали ефективність утримання наночастинок під впливом постійних магнітів різної форми.Крім того, ми не оцінювали тривалий вплив магнітного поля на утримання наночастинок у пухлинних тканинах.
Переважають наночастинки із середнім розміром 195,4 нм.Крім того, суспензія містила агломерати із середнім розміром 1176,0 нм (Фігура 5A).Потім порцію фільтрували через відцентровий фільтр.Дзета-потенціал частинок становить -15,69 мВ (рис. 5B).
Рисунок 5 Фізичні властивості суспензії: (A) гранулометричний склад;(B) розподіл частинок при дзета-потенціалі;(C) ТЕМ фотографія наночастинок.
Розмір частинок в основному становить 200 нм (рис. 5C), вони складаються з одного MNP розміром 20 нм і сполученої органічної оболонки PLA-EDA-ICG з меншою електронною щільністю.Утворення агломератів у водних розчинах можна пояснити відносно низьким модулем електрорушійної сили окремих наночастинок.
Для постійних магнітів, коли намагніченість зосереджена в об’ємі V, інтегральний вираз ділиться на два інтеграли, а саме об’єм і поверхню:
У випадку зразка з постійною намагніченістю густина струму дорівнює нулю.Тоді вираз вектора магнітної індукції матиме такий вигляд:
Для чисельного розрахунку використовувати програму MATLAB (MathWorks, Inc., США), академічна ліцензія НТУ «ЛЕТІ» № 40502181.
Як показано на малюнку 7, малюнку 8, малюнку 9, малюнку-10, найсильніше магнітне поле створюється магнітом, орієнтованим аксіально від кінця циліндра.Ефективний радіус дії еквівалентний геометрії магніту.У циліндричних М. з довжиною циліндра, більшою за його діаметр, найбільш сильне магнітне поле спостерігається в аксіально-радіальному напрямку (для відповідної складової);тому пара циліндрів з більшим співвідношенням сторін (діаметр і довжина) MNP адсорбції є найбільш ефективною.
Рис. 7. Складова інтенсивності магнітної індукції Bz вздовж осі Oz магніту;стандартний розмір магніту: чорна лінія 0,5×2 мм, синя лінія 2×2 мм, зелена лінія 3×2 мм, червона лінія 5×2 мм.
Рисунок 8. Складова магнітної індукції Br перпендикулярна до осі Oz магніту;стандартний розмір магніту: чорна лінія 0,5×2 мм, синя лінія 2×2 мм, зелена лінія 3×2 мм, червона лінія 5×2 мм.
Рисунок 9 Складова Bz напруженості магнітної індукції на відстані r від торцевої осі магніту (z=0);стандартний розмір магніту: чорна лінія 0,5×2 мм, синя лінія 2×2 мм, зелена лінія 3×2 мм, червона лінія 5×2 мм.
Рисунок 10 Складова магнітної індукції в радіальному напрямку;стандартний розмір магніту: чорна лінія 0,5×2 мм, синя лінія 2×2 мм, зелена лінія 3×2 мм, червона лінія 5×2 мм.
Спеціальні гідродинамічні моделі можуть бути використані для дослідження способу доставки MNP до пухлинних тканин, концентрації наночастинок у цільовій зоні та визначення поведінки наночастинок у гідродинамічних умовах у системі кровообігу.Як зовнішні магнітні поля можна використовувати постійні магніти.Якщо ми ігноруємо магнітостатичну взаємодію між наночастинками і не розглядаємо модель магнітної рідини, достатньо оцінити взаємодію між магнітом і окремою наночастинкою в диполь-дипольному наближенні.
Де m — магнітний момент магніту, r — радіус-вектор точки, де знаходиться наночастинка, а k — системний фактор.У дипольному наближенні поле магніту має подібну конфігурацію (рис. 11).
В однорідному магнітному полі наночастинки обертаються лише вздовж силових ліній.У неоднорідному магнітному полі на нього діє сила:
Де похідна заданого напрямку l.Крім того, сила втягує наночастинки в самі нерівні ділянки поля, тобто збільшується кривизна і щільність силових ліній.
Тому бажано використовувати досить сильний магніт (або магнітний ланцюг) з явною осьовою анізотропією в області розташування частинок.
У таблиці 1 показано здатність одного магніту як достатнього джерела магнітного поля захоплювати та утримувати MNP у судинному руслі поля застосування.