Javascript наразі вимкнено у вашому браузері. Коли JavaScript вимкнено, деякі функції цього веб-сайту не працюватимуть.
Зареєструйте свої конкретні дані та конкретні препарати, які вас цікавлять, і ми зіставимо надану вами інформацію зі статтями в нашій великій базі даних і своєчасно надішлемо вам копію PDF електронною поштою.
Контролювати рух магнітних наночастинок оксиду заліза для цілеспрямованої доставки цитостатиків
Автор Торопова Ю., Корольов Д., Істоміна М., Шульмейстер Г., Пєтухов А., Мішанін В., Горшков А., Под'ячева Е., Гарєєв К., Багров А., Демидов О.
Яна Торопова,1 Дмитро Корольов,1 Марія Істоміна,1,2 Галина Шульмейстер,1 Олексій Пєтухов,1,3 Володимир Мішанін,1 Андрій Горшков,4 Катерина Подьячева,1 Каміль Гареєв,2 Олексій Багров,5 Олег Демідов6,71Національний медичний дослідницький центр ім. В.А. Алмазова Міністерства охорони здоров'я Російської Федерації, Санкт-Петербург, 197341, Російська Федерація; 2 Санкт-Петербурзький електротехнічний університет «ЛЕТІ», Санкт-Петербург, 197376, Російська Федерація; 3 Центр персоналізованої медицини, Державний медичний дослідницький центр ім. В.А. Алмазова Міністерства охорони здоров'я Російської Федерації, Санкт-Петербург, 197341, Російська Федерація; 4ФГБУ «Науково-дослідний інститут грипу імені А.А. Смородинцева» Міністерства охорони здоров'я Російської Федерації, Санкт-Петербург, Російська Федерація; 5 Інститут еволюційної фізіології та біохімії ім. І.М. Сеченова Російської академії наук, Санкт-Петербург, Російська Федерація; 6 Інститут цитології РАН, Санкт-Петербург, 194064, Російська Федерація; 7INSERM U1231, Медичний та фармацевтичний факультет, Університет Бургундія-Франш-Конте в Діжоні, Франція Зв'язок: Яна ТороповаНаціональний медичний дослідницький центр ім. Алмазова, Міністерство охорони здоров'я Російської Федерації, Санкт-Петербург, 197341, Російська Федерація Тел. +7 981 95264800 4997069 Ел. пошта [email protected] Передумови: Перспективним підходом до проблеми цитостатичної токсичності є використання магнітних наночастинок (МНЧ) для цілеспрямованої доставки ліків. Мета: Використати розрахунки для визначення найкращих характеристик магнітного поля, яке контролює МНЧ in vivo, та оцінити ефективність магнетронної доставки МНЧ до пухлин мишей in vitro та in vivo. Використовується метод MNPs-ICG. Дослідження інтенсивності люмінесценції in vivo проводилися на мишах з пухлинами, з магнітним полем та без нього в місці інтересу. Ці дослідження були проведені на гідродинамічному каркасі, розробленому Інститутом експериментальної медицини Державного медичного дослідницького центру ім. В.А. Алмазова Міністерства охорони здоров'я Росії. Результат: Використання неодимових магнітів сприяло селективному накопиченню МНЧ. Через хвилину після введення МНЧ-ІЦГ мишам з пухлиною, МНЧ-ІЦГ переважно накопичується в печінці. За відсутності та присутності магнітного поля це вказує на його метаболічний шлях. Хоча спостерігалося збільшення флуоресценції в пухлині за наявності магнітного поля, інтенсивність флуоресценції в печінці тварини з часом не змінювалася. Висновок: Цей тип МНЧ у поєднанні з розрахованою напруженістю магнітного поля може бути основою для розробки магнітно-контрольованої доставки цитостатичних препаратів до тканин пухлини. Ключові слова: флуоресцентний аналіз, індоціанін, наночастинки оксиду заліза, магнетронна доставка цитостатиків, таргетування пухлини.
Пухлинні захворювання є однією з основних причин смерті в усьому світі. Водночас, динаміка зростання захворюваності та смертності від пухлинних захворювань все ще існує. 1 Хіміотерапія, що використовується сьогодні, все ще є одним з основних методів лікування різних пухлин. Водночас, розробка методів зниження системної токсичності цитостатиків залишається актуальною. Перспективним методом вирішення проблеми її токсичності є використання нанорозмірних носіїв для цільової доставки ліків, які можуть забезпечити локальне накопичення ліків у пухлинних тканинах без збільшення їх концентрації. 2 Цей метод дозволяє підвищити ефективність та цільову дію хіміотерапевтичних препаратів на пухлинні тканини, одночасно зменшуючи їх системну токсичність.
Серед різних наночастинок, що розглядаються для цільової доставки цитостатичних агентів, магнітні наночастинки (МНЧ) викликають особливий інтерес завдяки своїм унікальним хімічним, біологічним та магнітним властивостям, що забезпечують їх універсальність. Тому магнітні наночастинки можуть бути використані як система нагрівання для лікування пухлин з гіпертермією (магнітна гіпертермія). Вони також можуть бути використані як діагностичні агенти (магнітно-резонансна діагностика).3-5 Використання цих характеристик у поєднанні з можливістю накопичення МНЧ у певній ділянці за допомогою зовнішнього магнітного поля, доставка цільових фармацевтичних препаратів відкриває перспективи створення багатофункціональної магнетронної системи для цільової доставки цитостатиків до місця пухлини. Така система включатиме МНЧ та магнітні поля для контролю їх руху в організмі. У цьому випадку як джерело магнітного поля можуть бути використані як зовнішні магнітні поля, так і магнітні імплантати, розміщені в ділянці тіла, що містить пухлину.6 Перший метод має серйозні недоліки, включаючи необхідність використання спеціалізованого обладнання для магнітного таргетування ліків та необхідність навчання персоналу для проведення хірургічних втручань. Крім того, цей метод обмежений високою вартістю та підходить лише для «поверхневих» пухлин, близьких до поверхні тіла. Альтернативний метод використання магнітних імплантів розширює сферу застосування цієї технології, полегшуючи її використання на пухлинах, розташованих у різних частинах тіла. Як окремі магніти, так і магніти, інтегровані в інтралюмінальний стент, можуть використовуватися як імплантати для пошкодження пухлин у порожнистих органах, щоб забезпечити їх прохідність. Однак, згідно з нашими власними неопублікованими дослідженнями, вони не є достатньо магнітними, щоб забезпечити утримання МНЧ з кровотоку.
Ефективність магнетронної доставки ліків залежить від багатьох факторів: характеристик самого магнітного носія та характеристик джерела магнітного поля (включаючи геометричні параметри постійних магнітів та силу магнітного поля, яке вони генерують). Розробка успішної технології доставки інгібіторів клітин за допомогою магнітного керування повинна включати розробку відповідних магнітних нанорозмірних носіїв ліків, оцінку їхньої безпеки та розробку протоколу візуалізації, який дозволяє відстежувати їх переміщення в організмі.
У цьому дослідженні ми математично розрахували оптимальні характеристики магнітного поля для контролю магнітного нанорозмірного носія ліків в організмі. Можливість утримання НЧ через стінку кровоносної судини під впливом прикладеного магнітного поля з цими обчислювальними характеристиками також вивчалася на ізольованих кровоносних судинах щурів. Крім того, ми синтезували кон'югати НЧ та флуоресцентних агентів і розробили протокол для їх візуалізації in vivo. В умовах in vivo на мишах-моделях пухлини вивчали ефективність накопичення НЧ у тканинах пухлини при системному введенні під впливом магнітного поля.
У дослідженні in vitro ми використовували еталонний MNP, а в дослідженні in vivo – MNP, покритий поліестером молочної кислоти (полімолочна кислота, PLA), що містить флуоресцентний агент (індолеціанін; ICG). У цьому випадку використовують MNP-ICG (MNP-PLA-EDA-ICG).
Синтез та фізичні й хімічні властивості MNP були детально описані в інших джерелах.7,8
Для синтезу MNPs-ICG спочатку були отримані кон'югати PLA-ICG. Використовували порошкоподібну рацемічну суміш PLA-D та PLA-L з молекулярною масою 60 кДа.
Оскільки PLA та ICG є кислотами, для синтезу кон'югатів PLA-ICG спочатку потрібно синтезувати спейсер з кінцевою N-групою на PLA, який допомагає ICG хемосорбуватися зі спейсером. Спейсер був синтезований з використанням етилендіаміну (EDA), карбоїмідного методу та водорозчинного карбоїміду, 1-етил-3-(3-диметиламінопропіл) карбоїміду (EDAC). Спейсер PLA-EDA синтезується наступним чином. Додайте 20-кратний молярний надлишок EDA та 20-кратний молярний надлишок EDAC до 2 мл розчину PLA у хлороформі з концентрацією 0,1 г/мл. Синтез проводили у поліпропіленовій пробірці об'ємом 15 мл на шейкері зі швидкістю 300 хв-1 протягом 2 годин. Схема синтезу показана на рисунку 1. Повторіть синтез з 200-кратним надлишком реагентів для оптимізації схеми синтезу.
Після завершення синтезу розчин центрифугували зі швидкістю 3000 хв-1 протягом 5 хвилин для видалення надлишку осаджених похідних поліетилену. Потім до 2 мл розчину додали 2 мл розчину ICG з концентрацією 0,5 мг/мл у диметилсульфоксиді (ДМСО). Мішалку встановлювали на швидкість перемішування 300 хв-1 протягом 2 годин. Схема отриманого кон'югату показана на рисунку 2.
У 200 мг MNP ми додали 4 мл кон'югату PLA-EDA-ICG. Використовуючи шейкер LS-220 (LOIP, Росія), перемішували суспензію протягом 30 хвилин з частотою 300 хв-1. Потім її тричі промивали ізопропанолом та піддавали магнітній сепарації. Використовуючи ультразвуковий диспергатор UZD-2 (ФГУП НДІ ТВЧ, Росія), додавали IPA до суспензії протягом 5-10 хвилин під безперервною ультразвуковою дією. Після третього промивання IPA осад промивали дистильованою водою та ресуспендували у фізіологічному розчині з концентрацією 2 мг/мл.
Для вивчення розподілу розмірів отриманих наночастинок (НЧ) у водному розчині використовували обладнання ZetaSizer Ultra (Malvern Instruments, Велика Британія). Для дослідження форми та розміру НЧ використовували просвічуючий електронний мікроскоп (ТЕМ) з катодом польової емісії JEM-1400 STEM (JEOL, Японія).
У цьому дослідженні ми використовуємо циліндричні постійні магніти (марки N35; з нікелевим захисним покриттям) наступних стандартних розмірів (довжина поздовжньої осі × діаметр циліндра): 0,5×2 мм, 2×2 мм, 3×2 мм та 5×2 мм.
Дослідження транспорту НЧ у модельній системі in vitro проводилося на гідродинамічному каркасі, розробленому Інститутом експериментальної медицини Державного медичного дослідницького центру ім. В.А. Алмазова Міністерства охорони здоров'я Росії. Об'єм циркулюючої рідини (дистильована вода або розчин Кребса-Генселейта) становить 225 мл. Як постійні магніти використовуються аксіально намагнічені циліндричні магніти. Магніт розміщують на тримачі на відстані 1,5 мм від внутрішньої стінки центральної скляної трубки, кінцем до напрямку трубки (вертикально). Швидкість потоку рідини в замкнутому контурі становить 60 л/год (що відповідає лінійній швидкості 0,225 м/с). Розчин Кребса-Генселейта використовується як циркулююча рідина, оскільки він є аналогом плазми. Коефіцієнт динамічної в'язкості плазми становить 1,1–1,3 мПа∙с.9 Кількість адсорбованих НЧ у магнітному полі визначається спектрофотометрично за концентрацією заліза в циркулюючій рідині після експерименту.
Крім того, було проведено експериментальні дослідження на вдосконаленому столі гідромеханіки для визначення відносної проникності кровоносних судин. Основні компоненти гідродинамічної опори показані на рисунку 3. Основними компонентами гідродинамічного стента є замкнутий контур, що імітує поперечний переріз модельної судинної системи, та резервуар для зберігання. Рух модельної рідини вздовж контуру модуля кровоносних судин забезпечується перистальтичним насосом. Під час експерименту підтримують пароутворення та необхідний діапазон температур, а також контролюють параметри системи (температуру, тиск, швидкість потоку рідини та значення pH).
Рисунок 3. Блок-схема установки, що використовується для дослідження проникності стінки сонної артерії. 1 – резервуар-накопичувач, 2 – перистальтичний насос, 3 – механізм для введення суспензії, що містить MNP, у петлю, 4 – витратомір, 5 – датчик тиску в петлі, 6 – теплообмінник, 7 – камера з контейнером, 8 – джерело магнітного поля, 9 – балон з вуглеводнями.
Камера, що містить контейнер, складається з трьох контейнерів: зовнішнього великого контейнера та двох малих контейнерів, через які проходять плечі центрального контуру. Канюля вставляється в малий контейнер, контейнер нанизується на малий контейнер, а кінчик канюлі щільно зав'язується тонким дротом. Простір між великим контейнером і малим контейнером заповнений дистильованою водою, а температура залишається постійною завдяки з'єднанню з теплообмінником. Простір у малому контейнері заповнений розчином Кребса-Генселейта для підтримки життєздатності клітин кровоносних судин. Резервуар також заповнений розчином Кребса-Генселейта. Система подачі газу (вуглецю) використовується для випаровування розчину в малому контейнері в резервуарі для зберігання та камері, що містить контейнер (Рисунок 4).
Рисунок 4. Камера, в якій розміщено контейнер. 1 – Канюля для опускання кровоносних судин, 2 – Зовнішня камера, 3 – Мала камера. Стрілка вказує напрямок модельної рідини.
Для визначення індексу відносної проникності стінки судини використовували сонну артерію щура.
Введення суспензії MNP (0,5 мл) у систему має такі характеристики: загальний внутрішній об'єм резервуара та з'єднувальної труби в петлі становить 20 мл, а внутрішній об'єм кожної камери – 120 мл. Джерелом зовнішнього магнітного поля є постійний магніт стандартного розміру 2×3 мм. Він встановлений над однією з малих камер, на відстані 1 см від контейнера, одним кінцем звернений до стінки контейнера. Температура підтримується на рівні 37°C. Потужність роликового насоса встановлена ​​на 50%, що відповідає швидкості 17 см/с. Як контроль, зразки відбирали в комірці без постійних магнітів.
Через годину після введення заданої концентрації НЧ з камери відбирали рідкий зразок. Концентрацію частинок вимірювали спектрофотометром з використанням УФ-Візуального спектрофотометра Unico 2802S (United Products & Instruments, США). Враховуючи спектр поглинання суспензії НЧ, вимірювання проводили при 450 нм.
Згідно з рекомендаціями Rus-LASA-FELASA, усі тварини вирощуються та вирощуються у спеціальних установах, вільних від патогенів. Це дослідження відповідає всім відповідним етичним нормам для експериментів та досліджень на тваринах і отримало етичне схвалення від Національного медичного дослідницького центру імені Алмазова (IACUC). Тварини пили воду досхочу та регулярно годували.
Дослідження було проведено на 10 анестезованих 12-тижневих самцях імунодефіцитних мишей лінії NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/Szj, Джексонська лабораторія, США) вагою 22 г ± 10%. Оскільки імунітет імунодефіцитних мишей пригнічений, імунодефіцитним мишам цієї лінії дозволяється трансплантація клітин і тканин людини без відторгнення трансплантата. Миші з різних кліток були випадковим чином розподілені до експериментальної групи, і їх схрещували разом або систематично піддавали впливу підстилки інших груп для забезпечення рівного впливу спільної мікробіоти.
Лінію клітин раку людини HeLa використовували для створення моделі ксенотрансплантата. Клітини культивували в середовищі DMEM, що містило глутамін (PanEco, Росія), доповненому 10% фетальною бичачою сироваткою (Hyclone, США), 100 КУО/мл пеніциліну та 100 мкг/мл стрептоміцину. Лінію клітин люб'язно надала Лабораторія регуляції експресії генів Інституту клітинних досліджень Російської академії наук. Перед ін'єкцією клітини HeLa видаляли з культурального пластику розчином трипсину:версену 1:1 (Biolot, Росія). Після промивання клітини суспендували в повному середовищі до концентрації 5×106 клітин на 200 мкл та розводили матриксом базальної мембрани (LDEV-FREE, MATRIGEL® CORNING®) (1:1, на льоду). Приготовлену клітинну суспензію вводили підшкірно в шкіру стегна миші. Використовуйте електронні штангенциркулі для контролю росту пухлини кожні 3 дні.
Коли пухлина досягла 500 мм3, у м'язову тканину експериментальної тварини поблизу пухлини імплантували постійний магніт. В експериментальній групі (МНЧ-ІЦГ + пухлина-М) вводили 0,1 мл суспензії МНЧ та піддавали впливу магнітного поля. Необроблені цілі тварини використовували як контрольну групу (фон). Крім того, використовували тварин, яким вводили 0,1 мл МНЧ, але не імплантували магніти (МНЧ-ІЦГ + пухлина-КМ).
Флуоресцентну візуалізацію зразків in vivo та in vitro проводили на біовізуалізації IVIS Lumina LT серії III (PerkinElmer Inc., США). Для візуалізації in vitro в лунки планшета додавали 1 мл синтетичного кон'югату PLA-EDA-ICG та MNP-PLA-EDA-ICG. Враховуючи флуоресцентні характеристики барвника ICG, вибирали найкращий фільтр, який використовувався для визначення інтенсивності світла зразка: максимальна довжина хвилі збудження становить 745 нм, а довжина хвилі випромінювання – 815 нм. Для кількісного вимірювання інтенсивності флуоресценції лунок, що містять кон'югат, використовували програмне забезпечення Living Image 4.5.5 (PerkinElmer Inc.).
Інтенсивність флуоресценції та накопичення кон'югату MNP-PLA-EDA-ICG вимірювали in vivo на мишах з пухлинною моделлю, без присутності та застосування магнітного поля до ділянки, що цікавить. Мишей анестезували ізофлураном, а потім через хвостову вену вводили 0,1 мл кон'югату MNP-PLA-EDA-ICG. Необроблених мишей використовували як негативний контроль для отримання флуоресцентного фону. Після внутрішньовенного введення кон'югату тварину помістили на нагрівальний столик (37°C) у камеру флуоресцентного томографа IVIS Lumina LT серії III (PerkinElmer Inc.), підтримуючи інгаляцію з 2% анестезією ізофлураном. Використовуйте вбудований фільтр ICG (745–815 нм) для детекції сигналу через 1 хвилину та 15 хвилин після введення MNP.
Для оцінки накопичення кон'югату в пухлині перитонеальну область тварини накривали папером, що дозволяло усунути яскраву флуоресценцію, пов'язану з накопиченням частинок у печінці. Після вивчення біорозподілу MNP-PLA-EDA-ICG тварин гуманно евтаназували шляхом передозування ізофлуранового анестетика для подальшого відділення ділянок пухлини та кількісної оцінки флуоресцентного випромінювання. Для ручної обробки аналізу сигналу з вибраної області інтересу використовували програмне забезпечення Living Image 4.5.5 (PerkinElmer Inc.). Для кожної тварини (n = 9) проводили три вимірювання.
У цьому дослідженні ми не кількісно оцінювали успішність завантаження ICG на MNPs-ICG. Крім того, ми не порівнювали ефективність утримання наночастинок під впливом постійних магнітів різної форми. Крім того, ми не оцінювали довгостроковий вплив магнітного поля на утримання наночастинок у пухлинних тканинах.
Домінують наночастинки, середній розмір яких становить 195,4 нм. Крім того, суспензія містила агломерати із середнім розміром 1176,0 нм (Рисунок 5A). Згодом цю частину фільтрували через відцентровий фільтр. Дзета-потенціал частинок становить -15,69 мВ (Рисунок 5B).
Рисунок 5. Фізичні властивості суспензії: (A) розподіл частинок за розмірами; (B) розподіл частинок за дзета-потенціалом; (C) TEM-фотографія наночастинок.
Розмір частинок становить в основному 200 нм (Рисунок 5C), що складається з однієї наночастинки розміром 20 нм та органічної оболонки, спряженої PLA-EDA-ICG, з нижчою електронною щільністю. Утворення агломератів у водних розчинах можна пояснити відносно низьким модулем електрорушійної сили окремих наночастинок.
Для постійних магнітів, коли намагніченість зосереджена в об'ємі V, інтегральний вираз поділяється на два інтеграли, а саме об'ємний та поверхневий:
У випадку зразка з постійною намагніченістю густина струму дорівнює нулю. Тоді вираз вектора магнітної індукції матиме такий вигляд:
Для числових розрахунків використовувати програму MATLAB (MathWorks, Inc., США), академічна ліцензія ETU “LETI” номер 40502181.
Як показано на рисунках 7, 8, 9 та 10, найсильніше магнітне поле генерується магнітом, орієнтованим аксіально від кінця циліндра. Ефективний радіус дії еквівалентний геометрії магніту. У циліндричних магнітах з довжиною циліндра, що перевищує його діаметр, найсильніше магнітне поле спостерігається в аксіально-радіальному напрямку (для відповідного компонента); тому пара циліндрів з більшим співвідношенням сторін (діаметром та довжиною) для адсорбції наночастинок є найефективнішою.
Рис. 7. Складова напруженості магнітної індукції Bz вздовж осі Oz магніту; стандартний розмір магніту: чорна лінія 0,5×2 мм, синя лінія 2×2 мм, зелена лінія 3×2 мм, червона лінія 5×2 мм.
Рисунок 8. Компонента магнітної індукції Br перпендикулярна до осі магніту Oz; стандартний розмір магніту: чорна лінія 0,5×2 мм, синя лінія 2×2 мм, зелена лінія 3×2 мм, червона лінія 5×2 мм.
Рисунок 9. Компонента інтенсивності магнітної індукції Bz на відстані r від торцевої осі магніту (z=0); стандартний розмір магніту: чорна лінія 0,5×2 мм, синя лінія 2×2 мм, зелена лінія 3×2 мм, червона лінія 5×2 мм.
Рисунок 10. Складова магнітної індукції вздовж радіального напрямку; стандартний розмір магніту: чорна лінія 0,5×2 мм, синя лінія 2×2 мм, зелена лінія 3×2 мм, червона лінія 5×2 мм.
Спеціальні гідродинамічні моделі можуть бути використані для вивчення способу доставки наночастинок (НЧ) до пухлинних тканин, концентрації наночастинок у цільовій області та визначення поведінки наночастинок у гідродинамічних умовах у кровоносній системі. Постійні магніти можуть бути використані як зовнішні магнітні поля. Якщо не враховувати магнітостатичну взаємодію між наночастинками та не розглядати модель магнітної рідини, достатньо оцінити взаємодію між магнітом та окремою наночастинкою за допомогою диполь-дипольного наближення.
Де m – магнітний момент магніту, r – радіус-вектор точки, де розташована наночастинка, а k – системний коефіцієнт. У дипольному наближенні поле магніту має аналогічну конфігурацію (рис. 11).
В однорідному магнітному полі наночастинки обертаються лише вздовж силових ліній. У неоднорідному магнітному полі на них діє сила:
Де — похідна заданого напрямку l. Крім того, сила притягує наночастинки в найбільш нерівні ділянки поля, тобто кривизна та щільність силових ліній збільшуються.
Тому бажано використовувати достатньо сильний магніт (або ланцюг магнітів) з явною осьовою анізотропією в області розташування частинок.
У таблиці 1 показано здатність одного магніту як достатнього джерела магнітного поля захоплювати та утримувати наночастинки мічевини (MNP) у судинному руслі поля застосування.